Réussir sa purification de protéines par chromatographie sur colonne et gradient d’élution

avec les pompes péristaltiques & le collecteur de fractions LAMBDA OMNICOLL

La chromatographie sur colonne (CC) avec échange d’ions, interactions hydrophobes, affinité ou exclusion de taille est utilisée pour la purification des protéines et l’isolement de peptides, d’acides nucléiques ou de petites molécules à partir de milieux de fermentation.. 

Le collecteur de fractions OMNICOLL et les pompes péristaltiques de LAMBDA sont utilisés avec succès en laboratoire pour optimiser ces procédés de chromatographie liquide :

Méthodologie

Pour une bonne séparation d’un mélange de substances, il est important que la colonne ait été correctement remplie avec la phase stationnaire, sans bulle d’air ni de fissure.

La pompe péristaltique de LAMBDA délivre la phase mobile liquide de manière reproductible, continue et pratiquement sans pulsation sur la colonne de chromatographie garnie.

Le mélange de substances, appliqué au sommet de la colonne de chromatographie, est séparé lors de son passage à travers le matériau de remplissage (phase stationnaire) :

1. Les constituants du milieu de fermentation sont adsorbés avec plus ou moins de force sur la phase stationnaire, puis à nouveau désorbés, ce qui fait que les composants entrainés par la phase mobile (tampon) s’éloignent lentement les uns des autres.
2. Les différents composants du mélange, qui sont maintenant séparés les uns des autres, sont collectés en fractions à l’extrémité inférieure de la colonne de chromatographie à l’aide du collecteur de fractions OMNICOLL.
3. Un détecteur situé avant le collecteur de fractions fournit des informations sur la fraction dans laquelle la protéine recherchée en concentration élevée se trouve. Il est aussi possible d’analyser les fractions une fois récupérées.

Optimisation du processus d’élution pour la purification de protéines

Dans la purification enzymatique, trouver l’éluant optimal pour la chromatographie sur colonne revient à trouver le bon tampon.
Le choix du procédé d’élution a une grande importance sur la durée du processus de chromatographie liquide.

En chromatographie sur colonne, les protéines sont séparées en utilisant un solvant de composition constante (élution isocratique)

• si l’échantillon n’est pas très complexe et que les composants du mélange ont des temps de rétention différents.

Si l’échantillon est élué de la colonne de chromatographie avec un éluant de composition constante (élution isocratique), les protéines les plus fortement adsorbées ont besoin de beaucoup plus de temps pour être récupérées.
Dans le cas d’une élution isocratique on utilise un seul tampon et une seule pompe péristaltique.

Dans le cas d’une élution par gradient, la composition de la phase mobile (liquide) change au cours du processus de séparation. L’élution par gradient est avantageusement utilisée dans la purification des protéines dans les cas suivants:

• Séparation d’échantillons biologiques complexes
• Séparation des mélanges aux propriétés connues
• Séparation des composants ayant des temps de rétention proches

L’élution par gradient permet de réduire drastiquement le temps de rétention lors de la purification de protéines par chromatographie sur colonne.
Une élution par gradient nécessite l’emploi de deux tampons et une ou deux pompes péristaltiques.

Il est possible de réaliser un gradient d’élution avec une seule pompe péristaltique de Lambda :

Le fond du récipient contenant le tampon d’élution A et le récipient contenant le tampon d’élution B sont reliés l’un à l’autre par un siphon ou un tuyau. La vanne dans la connexion entre les récipients permet de régler le débit.

Le tampon d’élution A est constamment aspiré dans le bêcher pourvu d’une agitation et contenant le tampon d’élution B, ce qui en modifie la concentration du tampon.

La pompe péristaltique de LAMBDA programmable délivre le mélange, dont la concentration se modifie au cours du temps, dans la colonne de chromatographie.

L’éluat s’écoule de la colonne de chromatographie et passe à travers le détecteur qui mesure par exemple la valeur du pH, l’absorption à 280 nm ou la conductivité.

L’éluat s’écoule du détecteur vers le collecteur de fractions LAMBDA OMNICOLL : les fractions d’éluat sont collectées dans le récipient souhaité (n’importe quel volume ou forme, flacons, béchers ou tubes à essai, …).

L’emploi de deux pompes péristaltiques de LAMBDA permettent de produire des gradients d’élution reproductibles.

1. L’évolution de la composition de la phase mobile au cours du temps peut être programmée directement sur les pompes de LAMBDA puis affichée et enregistrée en continu sous forme de diagramme en temps réel à l’aide du logiciel de contrôle PNet.
2. La phase mobile dont la composition change au cours du temps traverse la colonne de chromatographie et les différents composants sont séparés.
3. L’éluat s’écoule de la colonne de chromatographie et passe à travers le détecteur qui mesure par exemple la valeur du pH, l’absorption à 280 nm ou la conductivité.
4. Le collecteur de fractions LAMBDA OMNICOLL, entièrement automatique, collecte les fractions en utilisant la programmation horaire ou un compte-gouttes.